发酵工业中微生物菌种的退化原因与复壮方法

菌种的退化与复壮

1.菌种的退化现象

随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。变异有正变异（自发突变）和负变异两种，其中负变异即菌株生产性能的劣化或有些遗传标记的丢失，又称为菌种的退化。但是在生产实践中，必须将由于培养条件的导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。因为优良菌株的生产性能是和发酵工艺条件紧密相关的，若培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。温度、pH的变化也会使发酵产量发生波动等，但只要条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。

常见的菌种退化现象中，易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变，如菌落颜色的改变、畸形细胞的出现等；菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失，例如放线菌、莓菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；菌种代谢产物的生产能力或其对宿主的寄生能力明显下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素发酵单位的减少，枯草芽孢杆菌产能力的衰退等。所有这些都对发酵生产不利。因此，为了使菌种的优良性状延续下去，必须做好菌种的复壮工作，即在各菌种的优良性状没有退化之前，定期进行纯种分离和性能测定。

2.菌种退化的原因

菌种退化的主要原因是相关基因发生了负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。般而言，菌种的退化是个从量变到质变的逐步演变过程：开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施而是味移种传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，后占优势，从而使整个群体表现出严重的退化现象，因此，突变在数上的表现依赖于传代，即菌株处于定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为株退化了的菌体。同时，对某菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的概率比处于休眠状态的细胞大得多，因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化，

3.防止退化的措施

（1）合理的育种

选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞；合理选释诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少回复突变；在诱变处理后进行充分的后培养及纯化突变，以保证保藏蓝种纯粹。这些都可有效地防止菌种的退化。

（2）选用合适的培养基

有人发现用老苜着根汁培养基培养“5406”抗生蓝——细黄链霉菌可以防止它的退化，在赤霉菌产生菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、、5-核苷酸或等物质时，也有防止菌种退化的效果，也可选取营养相对贫乏的培养基作为菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过蓝株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化概率。

（3）创造良好的培养条件

在生产实践中，创造和发现个适合原种生长的条件可以防止菌种迟化，如低温、于燥、缺氧等。在栖土曲霉3.942的培养中，有人曾用改变培养温度的措施（从20~30℃提高到33~34℃）来防止其产孢子能力的退化。

（4）控制传代次数

由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生的，所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到低水平，以降低自发突发的概率，菌种传代次数越多，产生突变的凝率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其他的保藏方式（真空冷冻于燥保藏、沙土管保藏、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。

（5）利用不同类型的细胞进行移种传代

在有些薇生物中，如放线菌和霉菌，由于其细胞中常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退的现象，而孢子般是单核的，用它接种时就没有这种现象发生，有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地蘸取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。

4.退化菌种的复壮

退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法来实现，其中种是从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以恢复菌种原有的典型性状。另种是在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以使菌种的生产性能逐步提高。所以这实际上是种利用自发突变不断从生产中进行选种的工作。

其体的菌种的复壮措施如下。

（1）纯种分离

采用平板划线分离法、平板稀释法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。

（2）通过宿主进行复壮

寄生型数生物的退化菌株可接种到相应宿主体内以提高菌株的活力，

（3）联合复壮

对退化菌株还可用高剂量的紫外线辐射和低剂量的DTG联合处理进行复壮。