巴氏杀菌机的工作原理是将混合原料加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4-5℃。因为一般细菌的致死点在温度68℃、时间30min以下，所以将混合原料经此法处理后，可杀灭其中的致病性细菌及绝大多数非致病性细菌；混合原料加热后瞬间冷却，急剧的热与冷变化也可以促使细菌的死亡。
在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快（一般微生物生长的适宜温度为28℃—37℃）。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4℃左右的温度下保存，且只能保存3~10天，最多16天。
当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。“低温长时间”(LTLT)处理是一个间歇过程，如今只被小型乳品厂用来生产一些奶酪制品。“高温短时间”(HTST)处理是一个“流动”过程，通常在板式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物，且在储存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏杀菌”主要应用于生产酸奶乳制品。国际上通用的巴氏杀菌机高温消毒法主要有两种：
一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌是有益人体健康的。
另一种方法是将牛奶加热到75~90℃，保温15~16s，其杀菌时间更短，工作效率也更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
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