SKD-200定氮仪的实验报告
时间：2016-07-15 阅读：630
实验目的：验证沛欧SKD-200型凯氏定氮仪对低蛋白量样品的检测准确度与度
实验设计人：沙金
实验执行人：沙金
实验时期：2010-3-11
仪器与试剂：
凯氏定氮仪（SKD-200，上海沛欧分析仪器有限公司）
精密分析天平（FA2004，上海精科天平厂）
通风橱
水槽
500mL三角瓶若干
25mL酸式滴定管
50mL量筒
1mL移液器与枪头
10mL离心管
药匙
称量纸
固体酸钾/酸铜催化剂=3:1（w/w）
样品1：0.5mg/mL BSA 2mL（containing 50% glycerol）
样品2：0.5 mg/mL 大豆浸提液 2mL (containing 50% glycerol）
样品3：标准酸铵 (1mg N/mL)
空白对照：saline (containing 50% glycerol）
浓酸(AR)
35% NaOH
2% H3BO3
混合指示剂：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液:0.1%甲基的红乙醇溶液=5:1
0.1N NaOH
0.1N HCl
0.01037N 滴定用HCl
操作步骤：
1. 消化：
将预先称量好的固体酸钾/酸铜催化剂粉末约6g（可适当加量）小心加入洗净干燥的消化管底部；分别将样品1、2和空白对照（约2mL）各两份用分析天平差减法直接倒入消化管底部，记录各组重量；用量筒小心称取浓酸16mL加入各消化管底部。将消化管放在管架上，放入消化炉，启动通风橱。设置消化温度时间曲线：170℃（根据样品碳化和沸腾的情况，可适当提高或降低预消化温度，并尽量避免样品碳化沸腾挂壁以提高检测准确度），30min——250℃，10min——370℃（为保证消化效果，可根据情况适当提高至400℃以上），120min。当消化管内出现稳定的恒沸白色酸雾并回流时，可盖上消化管盖以减少酸损失。当样品被消化为明亮的蓝绿色或绿色液体时，即可停止消化，待其冷却至室温后，取出蒸馏，关闭通风橱。
2. 蒸馏：
向凯氏定氮仪的三个储液桶中分别加入足量的35%NaOH、2%H3BO3和蒸馏水（根据处理样品量，至少1L），旋紧储液桶盖子。开机，打开循环水，不放入样品，预蒸馏2min。向样品管中小心加入20mL蒸馏水以稀释酸，待其变为明亮的蓝色溶液时，小心放入蒸馏架，卡紧卡槽时注意将消化样品管口卡紧以防止氨蒸气流失；向500mL接收三角瓶中加入少量（约0.6mL）混合指示剂，并设定加硼酸12s，加碱8s，蒸馏8—9min，保存设置后启动仪器。当氨蒸气随冷凝水流出时（注意氨蒸气管出口浸没于接收三角瓶的硼酸溶液中），接收瓶中的硼酸溶液会由玫红色变为蓝色，待蒸馏完毕，用蒸馏水将氨蒸气管出口的残液冲洗入接收瓶后取出待测。将样品管取出，小心倒入水槽，并及时清洗。放入下一个样品管和接收瓶，重复以上操作。蒸馏完毕后，关闭循环水。待蒸馏水冷却后放出。如短时间内不再使用定氮仪，应用蒸馏水替换酸液和碱液，重复加酸加碱过程以清洗酸碱管路，维护设备。
3. 滴定
用0.1N NaOH、0.1NHCl、蒸馏水分别润洗酸式滴定管各三次，zui后用0.01037N滴定用标准HCl润洗两三次。加入0.01037N滴定用标准HCl，并小心放液至0刻度。开始滴定，左手控制滴定速度，右手不断摇动混匀三角瓶中溶液。（可预先对样品消耗盐酸量有一个大致的估计，即每毫升0.01N盐酸可滴定约0.14mg氮）临近滴定终点时溶液开始由蓝色变为蓝灰色，在zui后一滴或半滴时微微呈现紫红色。视线与滴定管水平时读取并记录盐酸消耗量。用0.01037N滴定用标准HCl补满至0刻度后，可滴定下一个样品。
实验结果：
1. 各组样品取样量：
| 空白对照 | BSA (0.5mg/mL) | 大豆浸提液(约0.5mg/mL) |
取样前（g） | 9.823 | 9.191 | 9.702 |
*次取样后（g） | 7.391 | 6.639 | 7.016 |
第二次取样后（g） | 4.359 | 4.506 | 4.316 |
*次取样量（g） | 2.432 | 2.552 | 2.686 |
第二次取样量（g） | 3.032 | 2.133 | 2.700 |
*次取样量（mg） | 0.00 | 1.1285 | 1.1878 |
第二次取样量（mg） | 0.00 | 0.9432 | 1.1940 |
注：甘油密度1.2613g/mL，生理盐水密度1.00 g/mL，则样品溶液密度1.1307g/mL
蛋白取样量（mg）= 取样量（g）/ 样品溶液密度 X 0.5 mg/mL
2. 各组样品消耗盐酸量：
| 空白对照 | BSA (0.5mg/mL) | 大豆浸提液(约0.5mg/mL) |
*次取样量（g） | 2.432 | 2.552 | 2.686 |
第二次取样量（g） | 3.032 | 2.133 | 2.700 |
*次盐酸消耗量（mL） | 0.40 | 2.04 | 2.36 |
第二次盐酸消耗量（mL） | 0.45 | 1.64 | 2.44 |
*次滴定氮量（mg） | 0.058 | 0.296 | 0.343 |
第二次滴定氮量（mg） | 0.065 | 0.238 | 0.354 |
平均氮含量(mg/mL) | 0.026 | 0.129 | 0.146 |
平均蛋白含量(mg/mL) | 0 | 0.577 | 0.724 |
检测准确度 |
| 高于真实值15.4% | 高于真实值约44.7% |
检测度(SD%) | ±7.26% | ±2.75% | ±1.99% |
注：每消耗1mL0.01N的盐酸相当于0.14mg氮；动物胶K=5.6（N=18.0%），大豆制品K=6.0（16.7%）。
讨论：
从检测结果看，当测量氮含量为0.18mg时，标准偏差控制在±3%以内，而空白对照的含氮量进一步下降为0.03mg时，标准偏差仍控制在±10%以内，实验结果重复性较为理想。但两组实验测量值均大于真值，分析原因：1）BSA组高15.4%，怀疑实验场所距动物房较近，造成结果偏高。2）大豆浸提液组高44.7%，怀疑不仅有1）的原因，而且浸提液中含有较高的非蛋白氮干扰，建议将浸提蛋白沉淀后再以凯氏定氮法测量。
另：以标准酸铵检测的蒸馏回收效果，实验结果表明：当氮含量为1mg时，以1500W蒸馏器蒸馏8min，平均氮回收率为96.9%；以1500W蒸馏器蒸馏9min，平均氮回收率可达100%，蒸馏回收效果理想。建议对于低蛋白含量样品测量而言，降低蒸馏器功率，并适当延长蒸馏时间可进一步改善回收率，从而使结果重复性更好