生物固体微波杀菌及机理研究

微波加热原理
　　波是频率从300MHz～300GMHz的电磁波，其方向和大小随时间作周期性变化。微波与物料直接作用，将超高频电磁波转化为热能的过程即为微波加热过程。水是强烈吸收微波的物质，物料中的水分子是极性分子，在微波作用下，其极性取向随着外电磁场的变化而变化，915MHz的微波 可使水分子每秒运动18.3亿次，致使分子急剧磨擦、碰撞，使物料产生热化和膨化等一系列过程而达到微波加热目的 

微波杀菌机理

微波杀菌是微波的热效应和生物效应共同作用的结果。微波对细菌的热效应是使蛋白质变性，使细菌失去营养、繁殖和生存的条件而死亡；生物效应是微波电场改变细胞膜断面的电位分布，影响细胞周围电子和离子浓度，从而改变细胞膜的通透性能，细菌因此营养不良，不能正常新陈代谢，细菌结构功能紊乱，生长发育受到抑 制而死亡。此外，决定细菌正常生长和稳定遗传繁殖的核酸（RNA）和脱氧核糖酸（DNA），是由若干氢键紧密连接而成的卷曲形大分子。足够强的微波场可以导致氢键松驰、断裂和重组，从而诱发遗传基因突变，或染色体畸变，甚至断裂。 微波加热主要特点：1、加热迅速、
　　微波加热与传统的加热方式不同，不需热传导过程，它是使被加热物料本身成为加热体，因此即使是热传导性较差的物料，也可以在极短的时间内达到加热温度。
2、均匀

无论物体各部位形状如何，它是使物料表里表里同时均匀渗透电磁波而产生热能，不受物体形状限制，所以加热更均匀，不会出现外焦内生的现象

3、节能高效
　　由于含有水份的物质极易吸收微波而发热，因此，除少量的传输损耗外几乎无其它损耗。微波加热与远红外加热相比，节约能源1/3以上。
4、防霉杀菌，不破坏物料营养成分
　　微波加热具有热力效应和生物效应，因此，能在较低温度下杀死霉菌和细菌；传统加热方式加热时间较长，造成营养成分损失较大，而微波加热迅速，能zui大限度地保存物料的活性和食品中的营养成份。

5、工艺*，可连续生产
　　只要控制微波功率即可实现加热或终止。应用PLC人机界面可进行加热工艺过程规范的可编程自动化控制，它有完善的传送系统，可确保连续化生产，节省劳力。

6、安全无害
　　微波是控制在金属制成的加热室内工作，微波泄漏被有效抑制，不存在放射线危害及有害气体的排放，不产生余热和粉尘污染，极不污染实物也*。

城市生活污水中病原物种类繁多，zui常见的为肠道细菌、蠕虫寄生虫及病毒，其它（如真菌类、变形虫属等）则极少。这些病原物在污水处理过程中，大部分被保留或结合在生物固体颗粒物上，从而得到浓缩，其数量比污水中的数量要高得多。      生物固体作为农肥或土壤改良剂是目前主要的生物固体有效利用处置方法。要防止生物固体施用过程中对环境造成病原物污染，zui有效的措施就是减少生物固体中病原物的数量。我国农田灌溉水水质标准（GB5084-92）规定：粪大肠杆菌菌群数应小于10000个/L，蛔虫卵数应不超过2个/L，该标准指出灌溉水水质标准也适用于农用的生物固体，因此生物固体的杀菌处理应达到此项标准。      目前常用的生物固体杀菌处理方法有厌氧消化、自然干燥堆肥和热处理。厌氧消化杀菌效果不能达到农用标准，自然干燥堆肥杀菌时间长，热处理的效率一般。微波杀菌是制造一个物理环境使微生物死亡，这个环境包括热力的温度场和频率*的交变电磁场。两种物理场共同作用于生物固体中的微生物，从而达到杀菌的效果，克服了上述几种方法的不足。同时，微波对肠道细菌、蠕虫寄生虫和部分病毒都有杀菌作用，具有良好的应用前景。      大肠杆菌在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群，正常情况下一般不会致病，但它是条件致病菌。本实验以粪大肠杆菌作为指示菌，比较了微波杀菌和传统加热杀菌后生物固体中粪大肠杆菌菌群数的变化，通过酶活性检测和透射电镜观察，进一步探讨了微波杀菌的机理。1试验过程与方法1.1试验条件   试验设备为经过改装的微波炉，其腔体截面积为29cm×26cm，试验时，微波频率为2450MHz。1.2加热杀菌后粪大肠杆菌菌群数变化的检测    取500g含水率为60%的生物固体，摊铺于表面皿中，物料厚度1cm，置于恒温烘箱中，记录生物固体的温度刚好达到烘箱设定温度所需的时间。选择3种不同的温度（分别对应于3种不同功率处理5min的温度），从生物固体达到烘箱设定温度时开始记时，选择4种加热时间（5min、10min、20min、30min）进行杀菌处理，测定粪大肠杆菌菌群数。1.3微波杀菌后粪大肠杆菌变化的检测    取500g初始含水率为60%的生物固体，摊铺在微波炉托盘上，物料厚度1cm，选择3种微波输出功率（100W、300W、600W），5种不同的辐照时间（1min、2min、3min、4min、5min）在SL-800微波炉中进行处理，处理结束时迅速打开炉门测量载体的温度，并测定处理前后试样的粪大肠杆菌菌群数。1.4粪大肠杆菌菌群数检测方法    由含有N、P、S、K、Na等元素的无机盐、微量乳糖、微量蛋白胨、损伤型大肠杆菌复苏剂、杂菌抑制剂、酶底物及微量元素混合液等按比例配成培养基。采用两种不同的特定酶底物：邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）和4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸（MUG），分别与占粪大肠杆菌90%的埃希氏大肠杆菌产生的葡萄糖苷酸酶起反应，产生肉眼可辨的黄色产物邻硝基酚和在360nm紫外线照射下闪现蓝色荧光的4-甲基伞形酮水解产物。通过观察经24h 37℃培养后的水样的颜色变化及紫外线照射下的荧光现象，判断所检测水样中粪大肠杆菌菌群数的含量水平。    采用“4排20孔法”，以无本底蓝色荧光的玻璃试管为容器，每份水样平行做两份各20管，即在4排试管中分别加入原水样、10倍、100倍稀释水样和空白样对照液，取液量均为1ml，同时各加入培养基1ml及相应量的酶底物，经37℃恒温培养24h后，观察并记录每份水样中粪大肠杆菌菌群数（MPN值）。1.5透射电镜观察   取未处理生物固体试样、微波杀菌处理6min和12min的生物固体试样各1g，加10ml无菌蒸馏水，混匀5min，倒出上清液，以400r/min离心分离10min，取分离后的沉淀制成标本，以透射电镜生物样本制备法［4］对标本进行固定，用丙酮逐级脱水后，再以环氧树脂包埋，做成超薄切片。用醋酸铀及枸橼酸铅双染，在透射电镜下观察。1.6酶活性检测    取未处理生物固体试样、微波杀菌处理6min和12min的生物固体试样各1g，加10ml无菌蒸馏水洗涤，洗涤液静置5min，倒出上清液，用0.03mol/L磷酸盐缓冲液（Ph=7.4）稀释，在玻片上涂片。经Pearse标准法［5］处理后，在显微镜下观察乳酸脱氢酶（LHD）、辅酶Ⅱ（NADH）与细胞色素氧化酶（CCO）的变化。2结果与讨论2.1微波杀菌和加热杀菌效果的比较    将试验得到的粪大肠杆菌菌群数转换成对数值lgR，以处理时间为横坐标，lgR为纵坐标作图（图1、图2）。由图1和图2可知，100W微波功率条件下处理5min时，生物固体试样的温度刚刚达到35℃，此时残留菌群数的lgR值为4.27，而生物固体在35℃干热条件下，持续处理5min时残留菌群数的lgR值为4.53。600W微波功率条件下处理5min时，生物固体的温度刚刚达到90℃，残留菌群数的lgR值为0.65，而生物固体在90℃干热条件下，持续处理10min时残留菌群数的lgR值为4.38，两者的粪大肠杆菌菌群数相差4个数量级。同时，在300W以上功率的微波辐照下，生物固体辐照4min后，粪大肠杆菌菌群的lgR值已小于3，达到农用控制标准4的要求。而在90℃下，生物固体加热25min，lgR值仍未达到农用控制标准。说明微波杀菌的效果要远好于传统的加热杀菌。　   2.2微波杀菌的非热效应机制    电磁场作用于生物体，能引起两类生物效应：一类是热效应，指温度升高并由此而引起生理和病理变化的作用，这是生物体内各层次的生物物质吸收电磁波后转变为热能之故；还有一类为非热效应，指电磁场通过使生物体温度升高的热作用以新的方式改变生理生化过程的效应。微波作用能改变生物性排列聚合状态及其运动规律，而且微波场感应的离子流，会影响细胞膜附近的电荷分布，导致膜的屏障作用受到损伤，产生膜功能障碍，从而干扰或破坏细胞的正常新陈代谢功能，导致细菌生长抑制、停止或死亡。再则细胞中的核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）在微波场力作用下可导致氢键的松弛、断裂或重组。诱发基因突变或染色体畸变，从而影响其生物活性的改变，延缓或中断细胞的稳定遗传和增殖。    从分子运动观点考虑，温度实质是指分子热运动的剧烈程度，温度越高，分子热运动程度越剧烈，表明热力强度越大。传统加热杀菌实际上是热力强度造成细菌致死，而不是热量致死，它不能单纯从能量的数量转换来解释。同样，微波杀菌的作用，除了有热力强度致死因素，还有电磁辐照改变细菌生态活动致死的因素。细菌被微波辐照时所处的物理环境既包括温度场，也包括电磁场。在电磁场中细菌能出现电性质的强烈反应，例如，细胞内水分子作为电极性分子，在交变电磁场中出现随磁场频率变化的电极性振荡，电容性的细胞膜将被击穿而破裂。    用回归法计算微波杀菌和加热杀菌D值（图1和图2直线斜率的负倒数）。   由表1和表2可知，D值越小，杀菌速率越快，效果越好。100W微波功率下的D值（35.6）比60℃干热条件下的D值（48.3）小，到300W和600W微波功率下D值更小，相差得更大。　     由此可见，微波杀菌除了温度场的作用外，由于电磁场的存在，生物固体达到同样温度条件时，微波杀菌的效果明显好于加热杀菌，微波的灭菌速率也明显比加热杀菌快得多。说明微波杀菌过程中存在电磁场的非热效应。2.3透射电镜观察结果    在透射电镜下观察，正常大肠杆菌的细胞壁、细胞膜完整、光滑，细胞壁紧贴细胞膜，细胞浆内容均匀，见图3（a）。经微波杀菌处理6min后菌体变形，细胞壁与细胞膜间空隙增宽，细胞壁表面出现皱褶并部分模糊不清，细胞浆内容物不均匀，见图3（b）。微波处理10 min后，生物固体的含水率降低到40%以下，这样的变化更加明显，见图3（c）。 2.4酶活性检测    显微镜下观察LHD、NADH、CCO3种酶的结果为：LHD与NADH均为兰色，CCO为棕褐色。   经微波杀菌处理6min后（含水率53.5%）的染色涂片，3种酶的染色均较浅；微波处理12min后（含水率30.2%），样品染色涂片几乎无色。这表明，3种酶的活性近乎丧失。由此可以推断：微波通过抑制或破坏细胞内乳酸脱氢酶、辅酶Ⅱ与细胞色素氧化酶等与生物氧化、呼吸代谢及能量产生有关的酶的活性，导致细菌死亡。3结论   1） 初始含水率为60%的生物固体，经微波辐照处理后，卫生学检测指标（粪大肠杆菌菌群数的MPN值）可以达到农用控制标准的要求。     2） 微波处理过程中，生物固体刚刚达到干热杀菌控制的温度时，其杀菌效果就已经明显比干热杀菌效果好，证明微波杀菌过程中存在非热效应机制。     3） 微波是通过抑制或破坏微生物细胞内与生物氧化、呼吸代谢及能量产生有关的酶的活性来导致细胞死亡的。