大肠杆菌杂交
时间：2010-03-01 阅读：1377
一、实验原理
Lederberg和Tatum（1946）选用典型的大肠杆菌为材料，筛选营养缺陷型。利用双重和三重缺陷型的菌株，在简单的合成培养基上混合培养，在此培养基上只有重组子能长，亲本不能长，即所谓选择性培养，使细菌杂交获得成功。图12-1说明了细菌的基因重组是不同基因型的细菌经接触，接合后随之发生交换和杂种细菌分离的过程。
大肠杆菌的杂交试验中发现有些菌株经混合培养能得到重组子，有些却不能。1952年Hayes做了一个实验，他所用的二个菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株B是苏氨酸、亮氨酸和维生素B1的三重缺陷型。Hayes首先筛选链霉素抗性突变型ASr和BSr，然后在不含链霉素的基本培养基上进行正反杂交，结果没有不同，但在含链霉素的基本培养基上进行正反杂交，结果却不一样，在ASs×BSr杂交中能得到重组子，可是ASr×BSs杂交中却并不出现重组菌落。这一现象说明大肠杆菌中有不同的“性”，它与致育因子F有关。同时按细胞中有无F因子将大肠杆菌分为二类，有F因子的为F+，没有F因子为F-。F因子是一个小的DNA环状分子，分子量约4.5×106道尔顿。带有F因子的细胞，表面有一种称为性菌毛的毛状突起，长约1至20μ。性菌毛上有雄性专一噬菌体（MS2、k17、f2、Qβ等）的吸附位点，又和细胞的接合有关。F因子在细胞中能以二种状态存在；游离状态和整合到寄主染色体的一定位置。以致带有F因子的大肠杆菌可分为二类：F+和Hfr菌株。经吖啶橙处理F+变为F-，而Hfr性质不变，说明F因子在F+菌株中呈游离状态，而在Hfr菌株中则整合到寄主染色体的一定位置（图12-2）。
大肠杆菌杂交在F+与F-菌株之间进行，通过细胞的暂时沟通，形成局部合子。在部分合子的形成中，提供部分染色体或少数基因的菌称为供体菌，提供整个染色体的菌称为受体菌；所以F+和Hfr是供体细菌，F-是受体菌。F+和F-能杂交，Hfr和F-也能杂交，F-和F-则不能杂交；但这二个可杂交组合其特性不同，主要表现在：1.Hfr细菌和F-细菌杂交以后F-细菌性质不变，F+和F-细菌杂交以后F-细菌转变为F+（约70％）。2.F+和F-细菌杂交重组频率10-6，Hfr和F-细菌杂交重组频率高出F+菌株几百倍，称高频重组。
在F+与F-杂交中，F因子由F+供体高频转移到F-受体，低频转移宿主染色体的标志。原因是F+群体中每个细胞能转移性因子到F-受体，只有小部分细胞能转移染色体的标记。在Hfr与F-杂交中，Hfr供体的染色体由原点（在F因子内）开始转移进入受体菌，在这过程中F因子被割裂，F因子基因，一些是首*入，另一些是zui后进入。在这类杂交中只有当交配过程长到足以允许整个供体染色体被转移入F-受体，受体细胞才能由F-变为Hfr。
杂交实验有多种不同方法，这里介绍的是直接混合培养和液体培养。直接混合培养法操作简单，适用于确定二个菌株间能否杂交或测定重组频率的高低，而液体培养适宜于细菌的基因定位。
二、实验材料
大肠杆菌（EscherichiacoliK12）的四个菌株：K12Pro（λ）F+；W1485HisIleF+；W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr（λ）F-；HfrCMetTrp。
Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌体整合在染色体上，His：组氨酸，ilv：异亮氨酸缬氨酸，Thr：苏氨酸，Leu：亮氨酸，thi：维生素B1，xyl：木糖，Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麦芽糖，lac：乳糖，strr：链霉素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。
三、实验器具和药品
1.用具：灭菌培养皿（9厘米），灭菌三角瓶（150毫升），灭菌吸管（1、5、10毫升），灭菌离心管，灭菌空试管。
2.培养基：
（1）基本培养基Vogel50×*：MgSO4·7H2O10克，柠檬酸100克，NaNH4HPO4·4H2O175克，K2HPO4500克（K2HPO4·3H2O644克），蒸馏水约1，000毫升**（配好后放入冰箱保存备用）。
（2）平板用基本培养基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，琼脂2克***，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。
（3）液体*培养基（肉汤培养基）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸馏水100毫升，pH7.2，高压灭菌15磅/英寸215分钟。
（4）半固体培养基：琼脂0.7—1克，蒸馏水100毫升，pH7.0，高压灭菌15磅/英寸215分钟。
四、实验说明
大肠杆菌中除了不同型细胞的接合外，同型细胞F+与F+或*即浓度为使用浓度的50倍。
**将称好的药品分别溶解于670毫升蒸馏水中，待一种药品溶解后再放另一种药品，直至全部药品都溶解，然后加水定容到1.000毫升。
***琼脂的添加量由1.5—2克，根据琼脂的质量而定。凝固性能好的琼脂，可少加一些，反之，则要多加一些。Hfr与Hfr也能接合，但重组频率很低。细胞中的F因子使细胞壁的抗原发生了变化，这些不同于F性菌毛的表面成分阻止了F+与F+细胞杂交。经培养后处于饥饿条件下的F+细胞丧失了它们的表面排斥性，才能与其它F+细胞接合（这种改变是暂时的，一旦在新鲜培养基中，继续生长正常的表面特性又恢复），这些表型上的“F-细胞”称为拟表型。在抑制新的F性菌毛和表面成分形成的条件下生长，如低温下连续通气培养24—48小时，能增加拟表型的百分数。
1946年Lederberg和Tatum开始发现细菌的接合以后，普遍认为DNA的转移必需F+（Hfr）与F-细胞的紧密接触。Anderson等于1957年根据电镜照片指出接合细胞之间形成了桥。之后发现F+（Hfr）和性菌毛之间的关系，认为细菌染色体和专一雄性噬菌体通过性菌毛而转移。近来的电镜照片已经发现接合细胞通过性菌毛接触，并有实验依据。细胞接合后，供体中的DNA开始合成。一个单链DNA转移入受体并合成一条新的互补链；这过程能以DNA复制的滚环模型来说明。
上面提到带有F因子的大肠杆菌有F+和Hfr二类，实际上并不是所有的Hfr全是相当稳定的，在许多Hfr群体中含有回复子，在这些回复子中F因子不再整合在染色体上，而回复到游离状态，当F因子脱离寄主染色体时携带了细菌的基因，例如lac和gal等，这称之为F′因子。带有F′因子的菌称为F′菌株。F′菌株也能与F-杂交，现被广泛应用于细菌的研究工作。
五、实验步骤
1.菌液制备：
（1）实验前14—16小时，从冰箱保存的斜面菌种，挑少量菌于盛有5毫升*液体培养基的三角烧瓶中；每一个菌株接种一瓶，共接种4瓶，置37℃培养过夜。
（2）取出培养过夜的细菌，在W1177一瓶菌液中加入5毫升新鲜的*培养液，充分摇匀，等量分成2瓶；其余3瓶菌液分别用灭菌的5毫升吸管，各吸出2.5毫升菌液，然后再各加入2.5毫升新鲜的*培养液，充分摇匀，各菌于37℃继续培养3—5小时。
（3）自温箱取出三角烧瓶，分别倒入离心管，菌株W1177倒二支离心管，其余菌株各倒入一支离心管，离心沉淀，3，500转/分，离心10分钟。
（4）倒去上清液，打匀沉淀，加入无菌水，离心洗涤3次，再加无菌水到原体积。
2.杂交——混合培养：
（1）取12支灭菌试管，每支吸入3毫升经融化的半固体培养基，并保温在45℃（保温温度不宜高，北方气温低，可降低半固体中的琼脂量）。
（2）12支试管分成三个杂交组合，即W1177×K12pro；W1177×W1485；W1177×HfrC。每个组合各4支试管，其中2支对照，2支混合菌液。
（3）对照组试管各吸F+或Hfr供体菌菌液1毫升，其余按杂交组合各吸供体菌和受体菌菌液0.5毫升，充分混匀。
（4）将各试管中含菌的半固体倒在有Vogel培养基底层的平板上，摇匀待凝，放37℃培养，48小时后观察