细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒的使用方法
时间：2013-01-23 阅读：3456
1.准备溶液：温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽
提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的zui终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试
剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的zui终浓度为1mM。
2.对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，
并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽zui大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用*
消化细胞，以免*降解需抽提的目的蛋白。
3.对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽zui大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
4.每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。（对于二百万Hela细胞，其细胞
沉淀的体积大约为20微升或40毫克。）
5.zui高速剧烈Vortex5秒，把细胞沉淀*悬浮并分散开。（如果细胞沉淀没有*悬浮并分散开，可
以适当延长vortex时间。）
6.冰浴10-15分钟。
7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。zui高速剧烈Vortex5秒，冰浴1分钟。
8.zui高速剧烈Vortex5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。
9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。（千
万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。）
10.对于沉淀，*吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。（不吸尽上清会
带来细胞浆蛋白的污染。）
11.zui高速剧烈Vortex15-30秒，把细胞沉淀*悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速
剧烈Vortex15-30秒，共30分钟。
12.4℃12,000-16,000g离心10分钟。
13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻
存。
14.对于新鲜组织：
A.把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B（例
如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B）。并加入PMSF至zui终浓度为1mM配制成
组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃
匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。
C.4℃1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。（吸上
清时千万不要触及沉淀。）
D.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开
始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋
白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。